前沿解读 | 通过生物信息学探寻骨关节炎枢纽基因和有效药物
骨关节炎（OA）是以进行性关节破坏为特征的慢性疾病，影响着全世界3.03亿人[1]。近年来，随着全球人口老龄化和肥胖等OA危险因素增加，导致OA发病率逐渐上升[2,3]。
尽管目前广泛认可的OA发病机制假说涉及生物力学损伤导致的炎症介质释放，从而激活不同炎症通路造成软骨损害[4]。但越来越多的证据表明，低度滑膜炎症（滑膜炎）也参与了OA的发展过程，并且可能对其影像学进展产生重要作用[5]。不仅如此，由于滑膜炎的病理变化复杂多样，且缺乏特异性治疗，因此有必要从滑膜的角度探讨OA的发病机制和诊断标志物，以寻找OA的治疗靶点，缓解症状并改善预后。
近年来的研究发现，铁死亡与OA密切相关，其可通过氧化应激、氧化还原及诱导炎症等作用于OA[6]。作为一种细胞死亡模式，其特征是由于铁依赖性脂质过氧化物的积累而引起的异常氧化，而谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）是铁死亡的重要调节因子[7]。Kennish等人的研究表明，血清中的铁蛋白水平会增加男性OA发生风险并与男性OA的严重程度呈正相关，这可能提示存在异常的铁稳态，但其在滑膜中的作用尚未完全了解[8]。
焦亡作为另一种细胞死亡方式，其特征是通过迅速的质膜破裂以及细胞内内容物和促炎性递质向细胞外释放，导致固有的炎症[9]。当模式识别受体( PRRs )诱导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1 ( caspase-1 )或caspase - 11活化时，焦亡发生并触发炎性细胞因子白细胞介素-1β ( IL-1β )和IL-18的释放。在OA中，由于存在低度炎症和细胞因子水平升高的情况，因此可以检测到IL-1 β和IL-18等细胞因子[10]。这些特征的存在，也提示了细胞焦亡可能与OA的发生和发展有关。
近年来，生物信息学工具已经成为处理微阵列数据和确定差异表达基因（DEG）的标准方法之一。在此背景下，来自哈尔滨医科大学附属第二医院闫景龙教授及其团队结合生物信息学分析和验证，探索并筛选OA滑膜组织的枢纽基因，探讨它们与铁死亡或焦亡的相关性，构建上游源RNA（竞争性內ceRNA）调控网络，评估这些基因作为OA预测或治疗靶点的可靠性。最后，再通过比较毒理基因组学数据库（CTD）、药物库和药物-基因相互作用（DGI）数据库，鉴定并验证了靶向途径和枢纽基因及相应靶点的潜在药物。此项研究于2023年2月9日发表于《Front Genet》期刊上，现对该研究的概况、意义进行解读。
数据收集与分析
本研究使用Gene Expression Omnibus（GEO）作为数据来源，在搜索框中输入“Osteoarthritis”作为关键词进行检索。选择了GSE55235和GSE55457作为本研究的数据集，并使用MINiML格式下载了这些数据。
使用R软件的limma软件包对每个数据集中骨关节炎和正常滑膜组织的mRNA表达数据进行分析。分析GEO中P值以纠正假阳性结果，并将P值<0.05和|log2(fold change)|>1作为阈值定义差异表达基因(DEGs)。随后使用火山图和热图对DEGs进行可视化，并使用交集确定了共同的DEGs。
接下来，使用Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery对常见的DEGs进行基因本体论（GO）注释，包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF），并使用“http://www.bioinformatics.com.cn”免费在线平台绘制柱形图进行可视化。使用R包“clusterprofiler”（Version 4）对常见的DEGs进行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG）通路富集分析，并使用Metascape对常见的DEGs进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析。
研究者从6位患者中提取了滑膜细胞：其中3位患有骨关节炎（OA）；另3位患者没有OA，但因其他原因进行了半月板切除手术。研究通过IL-1β刺激OA组的FLS，以模拟OA的环境，并将依那西普和艾拉莫德一起添加到随后的测试中。随后还使用药物数据库搜索靶向KEGG通路的药物，以及使用qRT-PCR、ELISA、细胞活力测定和MDA检测等对FLS进行处理及活性评估。所有验证数据均以平均值±标准差（SD）呈现。使用GraphPad Prism 6.02进行统计分析。两组数值变量之间的差异通过t检验确定，而四组数值数据则通过One-way ANOVA后进行Bonferroni事后检验确定。以 p <0.05被定义为具有统计学意义。
研究结果与意义解读
研究从两个GEO数据库中获取了20个OA滑膜样本和20个正常滑膜样本，分析了它们的基因差异表达，筛选出了161个共同的差异表达基因（DEGs），并进行了GO注释和KEGG通路富集分析。在PPI网络分析中，得到了得分最高的前3个模块，并在最大模块中鉴定出8个基因作为中心基因，它们是ATF3、EGR1、FOSB、FOSL1、FOSL2、JUN、JUNB和MYC。此外，通过热图显示，选择了19个与铁死亡相关的基因和21个与焦亡相关的基因进行相关分析，得到了相关结果。最后，研究构建了中枢基因的ceRNA调控网络，并通过qRT-PCR和ELISA评估了对照组和OA组FLS中枢基因的mRNA和蛋白表达水平，发现JUN、MYC、EGR1、FOSL1和FOSL2的mRNA表达水平在OA组显著低于正常FLS组，而ATF3的表达高于正常FLS组。
图1 研究设计的流程图
确定GSE55235、GSE55457作为本研究的数据集后，根据p < 0.05和log2|FC|≥1的标准筛选DEGs。交叉后分别获得71个上调的DEGs和88个下调的DEGs，随后进行GO分析、PPI网络构建和KEGG通路分析。对枢纽基因与铁死亡或焦亡的相关性以及ceRNA的构建进行了研究。此外，对8个枢纽基因的表达进行了验证。最后，鉴定并验证了潜在的药物靶向通路和枢纽基因。DEGs =差异表达基因；FC =折叠变化；GO =基因本体；PPI =蛋白质-蛋白质相互作用；KEGG =京都基因和基因组百科全书；ceRNA =竞争性内源RNA。
此外，研究还使用了CTD、DrugBank和DGI数据库，筛选出针对8个中心基因和前4个KEGG通路的潜在药物，并发现了可以同时作用于多个基因和通路的药物。进一步选择了一些药物进行后续验证，并使用FLS与IL-1β共同处理来验证依那西普和艾拉莫德对FLS的作用。
通过细胞活性测试、细胞内ROS和MDA水平的检测、基因表达水平的检测以及FLS上清液中MMP-13和ADAMTS5水平的检测，研究者发现依那西普和艾拉莫德可以显著抑制FLS的生长速率、降低ROS和MDA的水平，增加EGR1、JUN和MYC的mRNA表达水平，并降低FLS上清液中MMP-13和ADAMTS5的水平。
图2 验证依那西普和艾拉莫德对FLS的影响的效果
(A) FLS的细胞活性在24和48小时的变化。(B)FLS相对胞内ROS浓度。(C)不同组FLS中MDA浓度的变化。(D-F)四个组中EGR1、JUN和MYC的mRNA表达。(G,H)不同组别FLS上清液中MMP-13和ADAMTS5的浓度。OA = 骨关节炎；Etan = Etanercept；IGU = Iguratimod；ROS = 活性氧；MDA = 丙二醛；MMP-13 = 基质金属蛋白酶13；ADAMTS5 = 含有血小板凝集素结构域的蛋白酶5。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
作为危及中老年人的主要慢性病之一，OA患病人群呈现年轻化趋势[11]。非药物治疗如康复治疗和物理治疗的依从性一般，手术治疗也存在高风险和高成本的问题[12]。证据表明，早期OA关节滑膜中存在单核细胞浸润和炎症介质的过度表达[13]。滑膜病变可以分泌关键的细胞因子，其中部分是基质金属蛋白酶（MMP）的主要调节因子，导致软骨丢失[14]。因此，深入研究滑膜炎症的分子机制对于预防和治疗OA具有重要意义。
总的来说，此次研究目的是识别参与骨关节炎病理生理学的关键基因。通过GO分析、KEGG通路分析、PPI网络构建和MCODE筛选，共筛选出了161个常见的DEG和8个中心基因，这些基因可能成为临床诊断和治疗骨关节炎的潜在靶点。此外，通过验证，其中有5个基因表达趋势与研究结果类似。随后，研究还讨论了中心基因与铁死亡和焦亡关键基因之间的关系。此外还确定了miRNA和lncRNA构成了中心基因的ceRNA调控网络。最后，研究发现依那西普和艾拉莫德作为潜在的靶向KEGG通路的两种药物，在骨关节炎环境中对FLS具有保护作用。
仅供医疗卫生专业人士阅读
作者：YXJ；
审校：哈拉哈提，高加索，颜爱竹；
美编：王贤；
正文图片：改编自原文；
封面图片：UgoMedia；