研究速递 | 依达拉奉右莰醇通过抑制NLRP3炎症小体诱导的小胶质细胞焦亡在缺血性脑损伤中发挥脑细胞保护作用
导语
来自郑州大学第一附属医院的宋波教授团队于《International Immunopharmacology》（IF=5.7142）发表文章，探讨依达拉奉右莰醇 (EDB) 对缺血性脑损伤的保护作用是否与NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡有关。该研究结果显示，EBD通过调节NF-κB/NLRP3/GSDMD通路抑制细胞焦亡，降低脑梗塞体积，抑制脑缺血后的炎症，从而起到脑细胞保护的作用。
研究背景
细胞焦亡 (pyroptosis) ，又称细胞炎性坏死，是新近发现的一种caspase依赖性的细胞程序性死亡形式，会释放大量的炎性细胞因子，如IL-1β和IL-18。Gasdermin D (GSDMD)是细胞焦亡的最终执行蛋白[1]，主要在小胶质细胞等中表达。GSDMD裂解后，质膜上出现裂孔使得成熟的IL-1β和IL-18从细胞质[2]释放。IL-1β是诱导外周和中枢免疫反应以应对感染或损伤[3]的关键细胞因子。
caspase-1的激活由炎性小体介导，包括NLRP3, NLRC4和NLRP1b[4]。促炎因子如NLRP3、pro-caspase-1、TNF-α、IL-6、pro-IL-1β和pro-IL-18的转录依赖于NF-κB信号通路，NF-κB信号通路是促炎反应[5]的重要调节剂（最常见的NF-κB二聚体是p65与p50组成的异二聚体[6]）。缺血性卒中（AIS）发生后，小胶质细胞作为中枢神经系统的常驻免疫细胞，以时间依赖的方式迅速激活，是导致AIS神经炎症的主要细胞[7,8]。
依达拉奉右莰醇 (EDB) 是一种新型的多靶点脑细胞保护剂，具有清除自由基、抗炎的作用，临床II期和III期研究显示AIS后48小时内使用EDB可显著改善患者90天功能预后[9,10]。
宋波教授带领团队从小胶质细胞的角度探讨EDB是否通过NF-κB/NLRP3/GSDMD信号通路调节细胞焦亡，从而对缺血性脑损伤产生保护作用，为阐明EDB的脑细胞保护作用提供了循证依据。
研究方法
体内试验采用60min短暂性大脑中动脉闭塞 (tMCAO) 模型，体外试验使用小鼠BV2小胶质细胞建立糖氧剥夺 (OGD) 模型；体内外试验分组均包含EDB不同剂量组，高剂量组(2.4 mg/kg)、中剂量组(1.2mg/kg)、低剂量组(0.6mg/kg)。（DSF：GSDMD抑制剂；MCC950：NLRP3抑制剂）
研究结果
1
EDB具有抗炎作用，可降低小鼠神经损伤和脑梗塞体积
图1、EDB对tMCAO诱导的炎症反应的减轻作用
图2、EDB对tMCAO后脑梗塞体积和神经功能损害的降低作用
该部分研究显示，tMCAO小鼠注射EDB可以使梗死体积下降（图2A、B）、死亡率下降（图2C）、mNSS评分下降（图2D）、神经功能得到改善（图2E）；同时EDB可减轻tMCAO后脑组织的炎症程度，尤其是可降低细胞焦亡相关的IL-1β和IL-18的水平（图1）。
2
在tMCAO小鼠模型和体外OGD条件下EDB对焦亡的抑制作用
图3、EDB对tMCAO诱导的焦亡的抑制作用
体内试验结果显示tMCAO小鼠脑组织中FL-GSDMD和Clv-GSDMD表达在第3天显著增加（图3A），但在给予中高剂量EDB后表达均明显减少（图3B、3C），同时前体IL-1β和活化IL-1β蛋白表达也降低（图3D、3E）；LDH检测显示细胞毒性水平降低（图3F）；免疫荧光显示GSDMD与Iba1双阳性细胞减少（图3G、3H）。
图4、EDB对OGD后小胶质细胞焦亡的抑制作用
体外试验结果显示，OGD处理BV2细胞48h后GSDMD水平达到最高（图4A、4B），在该条件下使用高剂量EDB后GSDMD水平、IL-1β、IL-18水平均下降（图4C-4F），LDH检测显示细胞毒性水平降低（图4G），caspase-1+PI细胞减少（图4H）、GSDMD与Iba-1双阳性细胞数下降（图4J）；同时该部分结果也显示高剂量的EDB对OGD处理后细胞GSDMD表达的影响与50µM的DSF（GSDMD抑制剂）相当（图4C-4J）。
3
EDB通过调节NF-κB/NLRP3/GSDMD通路对缺血性脑损伤起到保护作用
图5、EDB对OGD后NF-κB信号的激活及NLRP3炎性小体的抑制作用
体外试验显示，中、高剂量EDB处理的OGD细胞中NLRP3-炎症体 (包括NLRP3、caspase-1和含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)) 的表达显著受到抑制，MCC950（NLRP3抑制剂）处理后细胞caspase-1的激活受到抑制，表示高剂量的EDB可以通过抑制NLRP3来阻止caspase-1的激活（图5A、5B）；MCC950处理的OGD细胞中NF-κB信号的表达不受影响（即p65与磷酸化p65（p-p65）蛋白水平不变），而中高浓度的EDB显著抑制了OGD后p-p65的表达（即抑制了NF-κB信号通路的激活）（图5C、5D），表明NF-κB通路位于NLRP3炎症体的上游。
图6、EDB对tMCAO后NF-κB信号通路及NLRP3炎性小体的抑制作用
体内试验显示，脑缺血损伤显著增加了小鼠脑组织p-p65的水平（即NF-κB信号通路的激活），中高剂量的EDB处理可以抑制这一变化（图6A、6B）；而在MCC950处理的小鼠中，虽然p-p65的表达与对照组没有显著差异（图6C、6D），但NLRP3和caspase-1的表达显著降低（图6E、6F）；另外，脑缺血损伤也导致NLRP3炎症体的水平显著增加，EDB治疗降低了这些蛋白的表达增强（图6G、6H）。
研究结论
图7. AIS后，EBD通过抑制NLPR3炎症体引发的小胶质细胞焦亡的分子过程发挥抗炎作用，并减轻脑损伤
仅供医疗卫生专业人士阅读
作者：许扬飞；
审校：宋波教授，张莉娟，颜爱竹；
美编：王贤；
正文图片：改编自原文；
封面图片：UgoMedia；